论文摘要：本文根据植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1，对陕西和山西具有枣疯病的植株的总DNA进行PCR扩增，分别得到1433bp和1432bp的条带，其二者同源性达到99%以上。通过此16S rDNA序列进行Blast检索，挑选27条关于16S rDNA具有明确分组的植原体序列，分析同源性并绘制其系统进化树，结果表明它们和16S rDNA V-B组的遗传距离最近。通过pDRAW32软件，用17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶模拟RFLP，结果表明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似。进一步验证枣疯病植原体属于16S rDNA V-B ，说明其地域变异性不大，有利于枣疯病检测技术的建立。

　　论文关键词：枣疯病，植原体，分子检测，同源性

　　前沿

　　枣树原产我国，具有较高的营养价值。近年来，随着生活水平的提高，枣产品的需求量不断增加，枣树的栽培面积迅速扩大。新疆近年来也大力发展枣树产业，使得枣产业在新疆果业中占有一定份量。但是随着种植面积的增大，枣树病害也成为制约枣产业发展的一个重要因素。枣疯病堪称枣树的“艾滋病”，是一种毁灭性病害。目前没有比较实效的根治方法，所以通过PCR技术检测枣疯病就显得更为重要。

　　枣疯病病原是类似于菌原体的一种极小的微生物，1994年第十届国际菌原体组织大会上改称为植原体。植原体属于柔膜菌纲、植原体属，是一类无坚固细胞壁、存在于植物韧皮部筛管细胞内的原核生物。本文通过获得枣疯病植原体的16SrDNA序列，对枣树的植原体进行同源性分析，构建其系统进化树，为建立更为有效的枣疯病检测体系奠定理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　分别在2009年7月在陕西和山西采取具有枣疯病症状的植株，在石河子大学试验站采取健康植株，保存在-70℃冰箱里。

　　1.2实验方法

　　1.2.1枣树总DNA的提取

　　称取0.1-0.2g叶片，在液氮中迅速研磨至粉末，将粉末迅速转入预冷的1.5mL离心管中，加入1mlSTE（700mmol/LNaCl，100mmol/L，100mmol/LTris-Cl和50mmol/LEDTA），再加入5μLβ-巯基乙醇（BME），迅速混匀，在4℃下7000r/min离心6min，弃上清液，加人700mL预热的CTAB提取缓冲液（100mmol/LpH8.0Tris-Cl，50mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2%PVP，3%CTAB，2%BME）和12.5μL的BME，迅速摇匀，在65℃水浴30min（每8-10min上下颠倒一次），水浴结束后，加入等体积氯仿-异戊醇（24:l）后轻轻混匀，4℃离心10min。取上清液至1.5ml离心管中，同上再抽提一次。加入1/5体积的5mol/LNaCl混匀，再加2/3体积冰冷的异丙醇，-20℃静置20min以上。最后12000r/min离心5min，用75%的乙醇清洗2-3次，在室温下干燥10min，使其尽可能干燥。最后加入含有RNase的TE溶解，并置于37℃水浴30min。电泳检测，保存在-20℃即可。

　　1.2.2PCR扩增

　　根据Lee报道的关于16SrDNA的引物对：R16mF2（5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’），R16mR1（5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’）进行PCR扩增，以健康样品的总DNA和水为阴性对照，以带病样品的总DNA为阳性对照。反应体系为20?L，含有2?L10×PCRBuffer、1?L20?mol·L引物R16mF2、1?L20?mol·L、引物R16mR1、0.8?L0.25UdNTP、0.2?L1.25UTaqDNA聚合酶（上海生工公司），2?L枣树总DNA，13?LddHO。PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃45s，56℃45s，72℃1min35个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（EB染色），紫外透射仪下观察，并拍照记录实验结果。

　　1.2.3克隆测序

　　用百泰克的凝胶回收试剂盒回收目的片段，对其连接转化涂板。用碱式裂解法，提出含有目的片段的质粒DNA,并且对其用R16mF2/R16mR1引物对进行PCR扩增，验证目的片段是否已经连接上。最后送往上海生工进行测序。

　　1.2.4目的片段的序列分析

　　将所得的目的片段，进行Blast检索分析，并把测序结果登录在GenBank中，通过挑选较为典型的序列，ClustalX1.81对其多条序列进行分析，通过MEGA32软件构建系统进化树。挑选AluⅠ、MseⅠ和Tsp509Ⅰ等17种限制性内切酶，利用软件pDRAW32模拟RFLP，分析确定其种属关系。

　　2实验结果

　　2.1DNA的提取

　　通过CTAB法，提取的DNA如图1，由于植原体在枣树中分部不均匀，应该根据不同时期采取不同组织，本实验采取样品为叶子和枝条。通过对总DNA的粗提取物和总DNA提纯后的物质进行比对，由于枣树含糖量比较高，所以提纯后DNA的电泳效果较好，但是进行PCR比较，未测发现二者差异性，是否提纯DNA对实验的影响不大。此方法可以应用于枣树总DNA的提取中。

　　2.2PCR检测

　　dns副本副本

　　通过对带病的两个不同品种进行PCR检测，均可以扩增出1400bp左右的大小条带，而健康植株中和水中均不能扩增出此特异性片段，说明患有枣疯病的枣树中含有植原体（图2）。

　　图1枣树总DNA提取电泳图谱图2枣疯病植株总DNA的PCR产物电泳图谱

　　Ck：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株CK1：水CK2：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株Fig.1ElectrophoresispatternofFig.2ElectrophoresispatternofPCRproductsof

　　totalDNAfromJujubetotalDNAfromJWB

　　CK：healthyJujubeSX：JWBfromShaanxiCK1：DoubledistilledwaterCK：healthyJujube

　　SH：JWBfromShanxiSX：JWBfromShaanxiSH：JWBFROMShanxi

　　2.3测序检测及同源性分析

　　通过上海生工进行测序，在陕西和山西的材料中分别获得1433bp（JWB-NTSH）和1432bp（JWB-NTSX）两条不同的片段，GC含量较高，在GenBank中的登录号分别为GU594058、GU574807。应用DNAman软件分析JWB-NTSH和JWB-NTSX，同源性达到99.37%，通过Blast对比，与报道的植原体相关片段的同源性达到88%以上（表1），说明枣树枣疯病植原体随地域的变异不大，并且变异的区域被发现在几个较为集中的碱基上，使得枣疯病植原体的分类比较容易，有利于进行PCR检测植原体病害的存在。

　　表1枣疯病植原体与16Sr各组植原体核苷酸同源性分析

　　Table1AnalysisofNucleotideofJujubeWitchesBroomPhytoplasmaandphytoplasmaof16Srgroup

　　亚组分类

　　subgroup

　　相关植原体株系

　　Associated phytoplasma

　　Genbank

　　登录号

　　Genbank Accession No.

　　核苷酸的同源性

　　Nucleotide homology（%）

　　16Sr Ⅰ-A

　　番茄巨芽Tomato big bud（TBB）

　　L33760

　　89.41%

　　16Sr Ⅰ-B

　　西方翠菊黄花Severe westem aster yellow（SAY）

　　M86340

　　89.21%

　　16Sr Ⅰ-C

　　三叶草绿变Clover phyllody（KVF）

　　AF222066

　　89.69%

　　16Sr Ⅰ-D

　　泡桐丛枝Paulownia witches’broom（PaWB）

　　AY265206

　　89.21%

　　16Sr Ⅰ-E

　　杏褪绿卷叶Blueberry stunt-16Sr-E

　　AY265213

　　89.13%

　　16Sr Ⅰ-F

　　草莓褪绿Apricot chlorotie leaf roll

　　AY265211

　　89.34%

　　16Sr Ⅱ-A

　　甘薯簇叶病Sweet potato witchs’ broom（SPWB）

　　DQ452417

　　88.80%

　　16Sr Ⅱ-B

　　酸橙丛枝Witches’broom of line （WBDL）

　　U15442

　　88.73%

　　16Sr Ⅱ-C

　　蚕豆变叶Faba bean phyllody （FBP）

　　X83432

　　88.31%

　　16Sr Ⅱ-D

　　甘薯小叶Sweet potato little leaf（SPLL-V4）

　　AJ289193

　　88.66%

　　16Sr Ⅱ-E

　　木瓜黄皱 apaya yellow crinkle（PpYC）

　　Y10097

　　88.66%

　　16Sr Ⅲ

　　桃西方X病Peach westem-X disease, WX

　　L04682

　　92.67%

　　16Sr Ⅳ

　　椰子致死黄花Coconut lethal yellowing（LY）

　　L18747

　　93.72%

　　16Sr Ⅴ-A

　　榆丛枝病Elm witches’-boom（ULW）

　　L33763

　　98.39%

　　16SrⅤ-B

　　枣疯病Jujube witches’-broom （JWB ）

　　AY197661

　　99.65%

　　枣疯病山西株JWB-NTSH

　　GU594058

　　99.37%

　　16SrⅤ-C

　　悬钩子丛枝病Rubus stunt （RuS）

　　Y16395

　　90.00%

　　16Sr Ⅵ

　　三叶草簇叶Clover proliferation （CP）

　　L33761

　　92.74%

　　16SrⅦ

　　白蜡树黄化Ash yellows（AshY）

　　X68339

　　95.61%

　　16SrⅧ

　　丝瓜丛枝Loofah itches’broom（LfWB）

　　L33764

　　94.77%

　　16SrⅨ

　　木豆丛枝Pigeon pea witches’boom（PPWB）

　　AF248957

　　92.26%

　　16SrⅩ

　　苹果丛簇Apple proliferation（AP）

　　AF248958

　　90.01%

　　16SrⅩI

　　水稻黄矮Rice yellows dwarf （RYD）

　　D12581

　　93.23%

　　16SrⅩII

　　澳大利亚葡萄黄化Australian grapevine yellows（AGY）

　　X76427

　　87.87%

　　16SrⅩIII

　　墨西哥大草白叶Mexican periwinkle virescence（MPV）

　　AF248960

　　88.45%

　　16SrⅩIV

　　百慕大草白叶Bermuda grass white leaf （BWL）

　　EF444486

　　93.23%

　　16SrⅩV

　　扶桑丛枝Hibiscus witches -broom（HibWB）

　　AF147708

　　88.66%

　　2.4构建系统进化树

　　将JWB-NTSH和JWB-NTSX同已报道的16SrRNA进行对比，构建进化树，通过软件ClustalX1.81和软件的MEGA4构建进化树从GenBank中挑选植原体16SrDNA的15个种，27条具有确定种属关系的代表性序列（见表1），把这些序列通过ClustalX1.81进行分析，并应用MEGA4软件构建系统进化树。如图3所示，其中JWB-NTSX被划分到16SrDNAV-B中，和已知的枣疯病植原体属于同一个亚种，JWB-NTSH和JWB-NTSX还是有一定的差异性，说明枣疯病植原体随地域的变化可能发生变异，但是变异的碱基比较集中，和Blast中搜索的植原体变异的区域类似，说明同枣疯病植原体序列比较保守，这使得枣疯病的分类比较容易，更有利于枣疯病分类及其检测的研究。

　　图3枣疯病植原体及相关植原体16SrRNA基因核苷酸序列的系统发育树

　　Fig.3PhylogenetictreeofJWBandotherrelatedphytoplasmasbasedonthe16SrRNAgenesequences

　　2.4RFLP模拟

　　通过软件pDRAW32软件对JWB-NTSH，JWB-NTSX及JWB以及PPWB进行模拟RFLP试验，其中选取已报道的区别16SrDNA种属的17种典型的限制性内切酶。实验结果表明JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB酶切图基本相同，其中JWB-NTSH和JWB在HaeIII和MseI两处不同，JWB-NTSX和JWB在RsaI一处不同。说明JWB-NTSX和JWB的关系比JWB-NTSH和JWB的关系近。而JWB-NTSH和JWB-NTSX均和PPWB的酶切图在AluI、BstUI、DraI、HinfI等处不同，此结果进一步验证系统进化树的分析结果的正确性。说明来自陕西和山西的枣树植原体均属于16SrDNAV-B组。

　　图4JWB模拟RFLP图图5JWB-NTSHRFLP

　　Fig.4VirtualRFLPpatternsofJWB-NTSXFig.5VirtualRFLPpatternsofJWB

　　图6JWB-NTSX模拟RFLP图图7PPWB模拟RFLP图

　　Fig.6VirtualRFLPpatternsofJWB-NTSHFig.7VirtualRFLPpatternsofPPWB

　　3讨论

　　本文主要研究的是通过对患有枣疯病的植株进行总DNA提取，利用Lee设计的通用引物对枣疯病总DNA进行PCR扩增，克隆测序，获得16SrDNA的部分序列。通过研究16SrDNA的序列，发现来自陕西和山西不同地方的带病植株，其序列的同源性达到99.37%，与报道的植原体相关片段的同源性达到88%以上。通过查阅植原体16SrDNA相关文献，挑选出植原体16SrDNA的15个种，27条种属明确的代表性序列。通过构建系统分类树，发现JWB-NTSH和JWB-NTSX均属于16SrDNAV-B中，与已经报道的植原体分类相符合。同时挑选出关于植原体16SrDNA分类的典型的17种限制性内切酶，模拟RFLP对其分类做进一步验证，JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB酶切图基本相同，而JWB-NTSH和JWB-NTSX均和PPWB的酶切图在AluI、BstUI、DraI、HinfI等处不同，说明JWB-NTSX和JWB-NTSH及JWB亲缘关系比较近，和PPWB的亲缘性较远，此结果和构建的系统分类树分析结果是一致的，所以枣疯病植原体应该被分到16SrDNAV-B组中，为枣疯病植原体的分类提供可靠的分子水平的理论依据。

　　4结论

　　近年来，新疆枣树产业不断的发展，枣疯病的研究就显得极其重要。目前我们在新疆南疆发现具有枣疯病症状的植株，本文通过对枣疯病植原体16SrDNA进行PCR扩增检测，并且通过构建其系统分类树和模拟RFLP实验，确定出枣疯病植原体的变异随地区差异性较小，并进一步确定其属于16SrDNAV-B组，为建立更为灵敏准确的枣疯病检测体系建立理论基础。

　　参考文献

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