论文摘要：采用病原形态鉴定方法和根结线虫核糖体基因内转录区保守序列的的PCR鉴定方法，对采自我国黄河古道区域葡萄根结线虫病株进行了病原物分离，进行根结线虫的形态鉴定分子鉴定。对线虫二龄幼虫的核糖体DNA进行了分离，利用通用引物18S和28S，采用PCR技术对分离到的根结线虫的核糖体基因（ribosomal DNA, rDNA）内转录间隔区（Internal Transcribed Spacers, ITS）保守序列进行扩增，获得片段长度约为766bp，并进行了序列分析。在NCBI上对其序列进行了同源性比较，结果表明，从黄河故道地区分离的葡萄病原线虫与南方根结线虫ITS序列同源性达到100%，结合形态鉴定分析，证明黄河故道地区的葡萄根结线虫病害病原为南方根结线虫。

　　论文关键词：葡萄，根结线虫，南方根结线虫，核糖体基因，内转录间隔区

　　*通讯作者。Authorforcorrespondence.Tel:13608692946,E-mail:honglianli@sina.com

　　wereusedtocomparethesequencebysoftwareBLASTnandBLASTx.Theresultshowedthattheidentityoftwosequencereach100%.Thisindicatedthatthepathogenofroot-knotdiseasewasM.incognitaintheareaofeastYellowRiverregion,anditalsoindicatedthatthedetectionresultaccordingtotheprocedurewasreliable.

　　葡萄根结线虫病是制约葡萄生产的世界性病害，危害日益严重，轻者造成减产，严重时毁园。自1889年Neal首次报道加州的葡萄发生根结线虫病，为害葡萄的根结线虫在世界分布的主要有四种：南方根结线虫（Meloidogyneincognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、爪哇根结线虫（M.javanica）、北方根结线虫（M,hapla）。另外在法国有M.marioni，在意大利有泰晤士根结线虫（M.thamesi）。近年来，随着分子生物学技术在线虫鉴定中的应用，分子鉴定已应用于根结线虫的分类鉴定中并取得了很大的进展。关于根结线虫的分子鉴定，前人已作出了很大的工作。

　　葡萄根结线虫病在黄河古道地区普遍发生，对葡萄生产和育苗造成很大的危害。只有在明确其具体种类后，才能进一步深人开展其它方面的研究，如线虫与寄主间的分子互作、抗线虫基因的筛选和利用，以及有效的防治方法等。因此，准确鉴定本区域内病原线虫的种类具有极其重要的意义。我们对黄河古道地区的葡萄感病病株根结进行了病原线虫的分离培养，从形态学和分子生物学两方面对其进行鉴定，以明确黄河故道地区的葡萄根结线虫种类，为线虫病害防治以及今后研究工作提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　葡萄根结线虫病病原线虫的来源和分离：河南洛阳孟津、郑州郊区、开封陈留、商丘平台、安徽砀山果园场、萧县等6个不同地区采集线虫感染的葡萄根系，带回试验室，用强水流冲洗，选择膨大根结，挑取成熟雌虫和卵囊备用。

　　1.2方法

　　1.2.1根结线虫形态鉴定

　　将成熟卵囊置灭菌水中，25℃培养24小时。收集二龄幼虫，在显微镜下观察其形态并照相。挑取成熟雌虫，观察其形态并照相。根据致病症状和线虫形态进行初步判断。判断标准参照刘维志等方法进行。

　　1.2.2根结线虫rDNA提取

　　参考彭德良等的方法并加以改进，具体方法为：挑取1个成熟卵囊放入灭菌的Eppendorf管中捣碎，加入10μL灭菌重蒸水，25℃培养24小时，充分搅匀后去杂质，-20℃冷冻2h，用灭菌牙签的端部充分研磨2-5min，再加入9μL蛋白酶K溶液（1mg/ml）（Promega,USA），离心30s，继续-20℃冷冻2h，将Eppendorf管置65℃下温浴1h，95℃10min，最后12,000r/min离心1min，取上清DNA悬浮液-20℃保存备用……

　　1.2.3ITS-PCR扩增

　　采用ITS片段的PCR扩增方法可以鉴定根结线虫，所用扩增引物为南方根结线虫rDNA的ITS区通用引物：

　　引物1（18S）：5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’

　　引物2（28S）：5’-TTTCACACGCCGTTACTAAGG-3’

　　具体方法为：

　　采用50μL的PCR反应体系：10×PCRBuffer5μL，引物各1μL，模板DNA10μL，PremixTaqDNA多聚酶25μL，灭菌重蒸水补足到50μL。同时设置无线虫DNA阴性对照，重复6次。

　　EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。扩增条件为：94℃4min；94℃30s，51℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。DNA扩增后离心，取10μL扩增产物加1μL加样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，150V下电泳40min,紫外光下观察和照相。

　　1.2.4PCR产物的回收

　　PCR产物采用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，具体操作步骤参照试剂盒操作说明。

　　1.2.5PCR产物的克隆、测序和序列分析

　　将纯化后的PCR产物与PGEM-TEasyVec-tor在4℃下连接12~16h，采用热击法转化到通过CaCl法制备的E.coliDH5a感受态细胞（TIANGEN公司）中。在含有Ampicillin（100mg/L），IPTG（24mg/L）和X-gal（200mg/L）的LB筛选平板上挑取单个白色菌落于含有Ampicillin（10mg/L）的液体LB中摇培过夜。采用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒DNA，经PCR鉴定后，筛选出含有正确插入片段的重组克隆送上海英俊公司进行序列测序，用ABI3730测序仪完成测序。所得序列用BLASTn和BLASTx软件与GeneBank中的序列进行同源比对分析（NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

　　2结果与分析

　　2.1根结线虫形态鉴定结果

　　挑取病株根结进行观察，可以看到根结外有透明黄褐色胶质包含着的卵囊，在显微镜下可以看到卵囊里充满了长椭圆形的卵，挑取卵囊，可以看到与卵囊紧密相连的呈梨形的雌虫，虫体乳白色，前体部突出呈现为瓶颈状，后体呈现为球形，食道垫刃型，中食道球发达，具有口针（图1）。二龄幼虫线形，长度约为500um，头部可以看到发育良好的食道腺和口针（图2）。

　　观察到的形态特征与刘维志等对南方根结线虫的特征描述相一致，由此初步判断病原线虫为南方根结线虫。

　　图1南方根结线虫雌成虫图2南方根结线虫2龄幼虫

　　Fig.1ThefemaleimagoofM.incognitaFig.2The2stagelarvaofM。incognita

　　2.2根结线虫rDNA–ITS的PCR扩增结果检测和序列分析结果

　　文本框： -fragment将试验获得的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上检测，检测时，六次重复，得到一条大约800bp的条带（图3）。

　　六次重复的电泳结果完全一致。说明的到的序列是线虫rDNA–ITS的特异扩增结果。重复性和一致性极好。

　　2.3根结线虫rDNA–ITS的PCR扩增片段的序列分析

　　将所获得的克隆通过测序得到一条766bp的片段，测序后，以通用引物为测序引物，用ABI3730测序仪完成测序。产生的序列去除载体和接头序列后，在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）用BLASTn和BLASTx软件与GeneBank中的序列进行同源比对分析。它与南方根结线虫（M.incognita）的ITS区编码序列AY438556具有同源性，相似度达到100％，排除期望值为Expect=0.00。所以判断所得到的线虫为南方根结线虫（M.incognita）。南方根结线虫的ITS区序列如下：

　　1TTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTGCCCGGGACT51GAGCCATTTCGAGAAATTTGGGGACCGTTGATTTAATTTTTCTAAATTACT101TTGATGGAAACCAATTTAATCGCAGTGGCTTGAACCGGGCAAAAGTCGTA151ACAAGGTAGCTGTAGGTGAACCTGCTGCTGGATCATTACTTTATGTGATGTT201CAAATTTGAATTCGCAATGAAATGATCGTTGTGAAACGGCTGTCGCTGGT251GTCTAAGTGTTGCTGATACGGTTGTGAACGTCCGTGGCTGTATATGTGGT301GACATGTTAGGACTCTAATGAGTTTAAGACCTAATGAGCCTCTTAAGTGA351GGCCGCCAGCAACCTTTTTTTTCTCTACATTTTAAAAAAAAAACTAAAAT401TCTACCCTTATCGGTGGATCACTAGGCTCGTGGATCGATGAAgAACGCAGC451AAACTGCGATAATTATTGCGAACTGCAGAAGTATTGAGCACAAAAGTTTT501GAACGCAAATGGCCGCATTGAGGTCAAACTCTTTGCAACGTCTGGTTCAG551GGTCATTTTCTCTTATAGCGGAAGCTTTAATTTCTATAATGATGTTGTTG601CTTTATATTTTAAAAGGATTTTTGTTTATTCATGTATTAAATCTAACTGT651GAAAATCAAACAATTTTGACCTGAACTCAGTCGAGAGCACCCGCTGAAC701TTAAGCATATCAGTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAAATAGGATTCCCTTAG751TAACGGCGGTGTGAAA

　　综合症状、形态学上的观察和提取的线虫ITS区域片段的对比结果，可以判断采集到的线虫为南方根结线虫，通过单卵块的繁殖可以保证获得供试线虫的纯度。

　　3讨论与结论

　　根结线虫的鉴定方法主要分为形态鉴定和分子鉴定两种方法，形态鉴定法中又以雌虫会阴花纹和同工酶鉴定方法为主，但雌虫会阴花纹个体间常常存在差异，并且在标本制作上需要一定的技巧，同工酶鉴定虽然较为准确，但却需要年轻雌虫的存存，而土样中往往只含有幼虫，因而限制了该方法的应用。近年来国际上兴起了适用于根结线虫各虫态的分子诊断法的研究，在多种果树根结线虫病害以及多种线虫群体的鉴定上发挥了重要作用。本试验即采用根结线虫rDNAITS-PCR扩增的方法，用一对通用引物对我国黄河故道地区葡萄根结线虫群体进行了鉴定，首先，验证了该方法的特点：（1）简便：PCR条件一致，无须对PCR产物进行限制性酶切；（2）灵敏：可对单条二龄幼虫直接进行鉴定；（3）快速：从线虫分离到得出结果一般少于6小时。其次，利用根结线虫形态鉴定与分子鉴定方法结合，明确了引起黄河故道地区根结线虫病害的主要群体，即南方根结线虫（M.incognita）。对今后黄河故道地区葡萄根结线虫的研究和防治奠定了基础，同时，也为葡萄抗线虫育种提供了理论依据。

　　目前，由于抗线虫基因的单一性，而大部分化学杀线剂都会引起环境污染，因此，快速准确的对病原线虫的鉴定，对于应用葡萄抗线虫性、抗性砧木的筛选、检疫以及防治根结线虫病害，确保葡萄的高产及安全生产具有极其重要的意义。

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