论文摘要：以秦冠、富士及其杂交F 代为试材，连续3年对苹果褐斑病（Marssonina coronarian （Ell.Et Davis） Davis）和斑点落叶病（Alternaira alternata f. mali）进行田间调查，研究了两种病害的遗传趋势及F 抗性表现，并进行了抗病基因RAPD标记。结果表明：亲本秦冠属抗病品种（2-3级），富士属感病品种（4级）；F 代表现数量性状遗传规律，含有主效抗病基因；斑点落叶病的遗传基因的加性效应贡献较大，褐斑病的遗传主要受基因的非加性效应影响；获得1个与抗斑点落叶病基因连锁的RAPD标记S428-854，并成功转换为SCAR标记SCAR470。

　　论文关键词：苹果，早期落叶病，遗传，标记，标记

　　选育优质抗逆的苹果新品种是国内外苹果育种者不懈追求的目标，为减少果品生产中农药使用量、降低环境污染，抗病性已成为苹果抗逆育种的热点。早在上世纪50年代，美国已开始有计划的开展苹果抗“火疫病、黑星病”育种，并由3所大学合作成立PRI联合苹果育种计划，历经50多年已培育出40多个抗病品种；欧洲于20世纪90年代创立DARE（durableappleresistanceinEurope）项目，以抗“黑星病、白粉病”为主要育种目标，也取得了很大成就。迄今为止国际上关于苹果抗病（火疫病、黑星病、白粉病等）育种进行了深入的研究，在基础理论、育种技术等方面都取得了突破性进展。我国苹果抗病育种研究起步较晚，研究基础薄弱，沙守峰、阎振立等对苹果抗粗皮病和轮纹病进行了抗病性遗传变异研究。

　　苹果早期落叶病是我国苹果生产中三大主要病害之一。依据植物发病症状特点可分为五种类型：褐斑病（Marssoninacoronarian（Ell.EtDavis）Davis）、斑病落叶病（Alternairaalternataf.mali）、圆斑病（Phyllostccasolitaria）、灰斑病（Phyllostictapirina）、轮斑病（AlternariamaliRoberts），其中褐斑病和斑点落叶病危害最严重，常造成大片果树中下部叶片脱落，枝梢上苹果暴露在外，严重影响苹果树的正常生长、花芽形成、果实增大和来年苹果的产量与品质。目前日本、中国等亚洲苹果主产国对苹果早期落叶病做了一些研究，主要集中在病害流行规律、分布、病原菌生物学和病害防治等方面，有关品种资源的抗性遗传变异规律及育种研究鲜有报道。

　　本研究以秦冠和富士及其正反交F代为材料，通过连续3年的田间抗性鉴定，研究了苹果早期落叶病抗性遗传趋势，并进行抗斑点落叶病基因的RAPD和SCAR分子标记研究，旨在揭示我国苹果抗早期落叶病的遗传方式和特点及杂交后代的抗性表现，为苹果抗病育种和杂交后代抗病性早期选择提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　供试材料均取自西北农林科技大学白水苹果试验站。2004年春进行杂交，以秦冠和富士为亲本设计正反交，2005年春播种，获得4020株杂交实生苗，其中秦冠×富士（正交）组合2300株，富士×秦冠（反交）组合1720株，株行距为30cm×80cm，常规管理，实验期间不喷施任何杀菌剂，本实验随机选取正交385株，反交322株，亲本于2005年8月嫁接于同一苗圃内，各嫁接5株，砧木为M26。

　　1.2方法

　　1.2.1病害调查标准

　　苹果早期落叶病调查标准参照《农业部新农药田间药效试验准则》中斑点病的分级标准，如表1所示。

　　表1苹果早期落叶病分级标准

　　Table1Classesofresistancetoappleearlydefoliationdisease

　　病级代表值（X）

　　Value of grade

　　病斑面积占叶面积比例（%）Percentage of the disease spot on total leaf

　　褐斑病Apple brown blot 斑点病Alternaria leaf blotch

　　0

　　X=0.0

　　X=0.0

　　1

　　0.0＜X≤10.0

　　0.0＜X≤10.0

　　3

　　10.0＜X≤25.0

　　10.0＜X≤25.0

　　5

　　25.0＜X≤50.0

　　25.0＜X≤40.0

　　7

　　50.0＜X≤75.0

　　40.0＜X≤65.0

　　9

　　X＞75.0

　　X＞65.0

　　将病级按下式换算成病情指数：

　　变异系数CV（%）=S/X×100；组合传递力（%）=F/MPx100；亲中值=父母本平均病情指数相加/2

　　（S:标准差；X:亲中值；F:F代平均值；MP:亲本平均值），用DPS2005进行数据分析。

　　1.2.2杂交F代病害调查

　　分别于2006～2008年在苹果早期落叶病的发病盛期，即7月中旬至9月中旬进行3次调查，取平均值。二年生杂交苗的调查：每棵树调查的叶片总数不少于70片，不足70片的单株全部调查；三、四年生杂交苗的调查：距地面120cm左右，按4个方位调查不少于100个叶片，统计各级病叶数，计算病情指数。

　　植株抗病性标准参考王昆等的方法，根据叶片病情指数，将其感病程度分为以下5级（表2）。

　　表2苹果早期落叶病抗性分级标准

　　Table2Classesofresistancetoappleearlydefoliationdisease

　　级别

　　Classes

　　抗病程度

　　Level of resistance

　　病情指数（DI）

　　Disease index

　　1

　　高抗（HR）High resistance

　　0.0＜DI≤5.0

　　2

　　抗病（R）Resistance

　　5.0＜DI≤10.0

　　3

　　中抗（MR）Middle resistance

　　10.0＜DI≤30.0

　　4

　　感病（S）Susceptible

　　30.0＜DI≤50.0

　　5

　　高感（HS）High susceptible

　　50.0＜DI≤100

　　1.2.3RAPD标记及SCAR转换

　　依据2006-2007年田间调查结果，以秦冠、富士、抗病单株、感病单株及其71株杂交F1代为材料，在展叶10-25天时取3-5g新鲜的叶片，采用改良CTAB法，参照王跃进的方法提取基因组DNA，跟据集群分类法（BSA）的原理，各选择7株高抗（1级）和高感（5级）单株建立抗、感基因池。

　　PCR扩增体系如下：10×Buffer2.5?l、dNTP（10mmoL/L）0.5?l、MgCl2（25mM）1.5?l、primer（20?moL/?L）0.75?l、Taq（5U/?L）0.2?l、模板DNA（40ng/?L）1.0?l、ddH2O18.55?l，Totalvolume25?l。94℃预变性5min，94℃变性50s，36℃退火50s，72℃延伸90s，38个循环，72℃延伸10min，最后于4℃保存。

　　用2.0％的琼脂糖凝胶，120V电压，电泳1h，用凝胶成象系统照像。

　　依据RAPD标记所获基因片段序列，运用PrimerPremier5.0软件设计SCAR引物（5'ATTCGAAGGTTGGGATGGAG3'/5'TAGCAGAAGTGACAAGAGGT3'），用所设计的引物对两亲本和构建的抗病池、感病池以及建池单株进行扩增。

　　2结果与分析

　　2.1亲本抗性评价

　　表3亲本抗性评价

　　Table3Theresistanceestimationofparents

　　品种

　　Variety

　　病害类型

　　Types of

　　disease

　　病情指数 （DI）Disease index

　　抗性级别

　　Level of

　　resistance

　　表现型

　　Pheno

　　-type

　　2006年

　　2006a

　　2007年

　　2007a

　　2008年

　　2008a

　　平均

　　Average

　　秦冠Qinguan

　　褐斑病

　　brown blot disease

　　15.4

　　17.0

　　16.5

　　16.3A

　　3

　　MR中抗

　　斑点病

　　alternaria leaf blotch

　　7.7

　　6.5

　　8.4

　　7.5A

　　2

　　R 抗病

　　富士

　　Fuji

　　褐斑病

　　brown blot disease

　　37.8

　　40.4

　　38.6

　　38.9B

　　4

　　S感病

　　斑点病

　　alternaria leaf blotch

　　30.8

　　33.4

　　35.9

　　33.3B

　　4

　　S感病

　　注：“A、B”示显著水平（P、B”Meanssignificantat1%leve

　　对于两种病害富士叶片3年的平均病情指数明显高于秦冠（表3所示），褐斑病是秦冠的2.3倍，斑点病是秦冠的4.4倍，差异达到极显著水平。秦冠对两种病害的抗性明显高于富士，依据抗性标准秦冠属于（2-3级）抗病品种，富士属于（4级）感病品种。

　　2.2杂交F代病害侵染规律及不同年份发病情况

　　表4苹果杂交F代不同年份间抗病性的相关分析（2006～2008年）

　　Table4Thecorrelationanalysisofdiseaseresistancein2006-2008

　　组合

　　The combination

　　of parents

　　病害类型

　　Types of

　　disease

　　2006年/2007年

　　2006a/2007a

　　2006年/2008年

　　2006a/2008a

　　2007年/2008年

　　2007a/2008a

　　秦冠×富士

　　Qinguan×Fuji

　　褐斑病

　　Brown blot disease

　　0.8548

　　0.7943

　　0.8269

　　斑点病

　　Alternaria leaf blotch

　　0.8683

　　0.8249

　　0.8355

　　富士×秦冠

　　Fuji×Qinguan

　　褐斑病

　　Brown blot disease

　　0.8329

　　0.8116

　　0.7817

　　斑点病

　　Alternaria leaf blotch

　　0.8968

　　0.8882

　　0.9175

　　两种病害的相关性

　　Correlation between two disease

　　ns

　　ns

　　ns

　　注：++代表极显著相关性P=0.01，+代表显著相关性P=0.05,ns代表没有显著相关性。

　　Notes：++,+,nsrepresentsignificantcorrelationatP=0.01,correlationatP=0.05,andnocorrelation,respectively.

　　苹果褐斑病主要侵染植株中下部老叶片，7-8月份出现高温多雨季节是褐斑病高发期，此时叶片开始脱落，植株不同基因型个体的抗感性明显表现出来；斑点落叶病菌主要侵染苹果新稍叶片，5-6月份出现一个侵染高峰，8-9月份是发病盛期，因此寄生在秋稍叶片上的分生孢子到9月份遇到高温多雨时大量繁殖，此时叶片上的病斑明显表现出来。不同年份间病害发生的相关性达到显著或极显著水平（表4），尤其是斑点病的相关系数3年间都达到极显著水平，说明在不同年份间植株的抗性表现比较稳定，但是由于受到环境因素的影响，极少部分植株的抗性表现会有所变化。杂交F代对两种病害的抗性没有显著的相关性，初步认为，这两种抗病基因不连锁，位于同一染色体相对较远的位置，或位于不同的染色体上。

　　2.3杂交F代抗病性遗传变异分析

　　图1苹果杂种F代病情指数分布图

　　Fig1DistributionofaveragediseaseindexofFprogenies

　　由图1可知，杂交F代褐斑病和斑点病的病情指数呈连续性变异（植株抗性表型变异并不连续），不符合标准的正态分布规律，属于数量遗传中的阈值性状。因此秦冠富士两个苹果品种杂交组合对褐斑病和斑点病的抗性是受多基因控制的数量性状，但是各等位基因对抗性的贡献大小是不均等的（图1所示），存在明显的峰值，即苹果对褐斑病和斑点病的抗性是主效基因和微效多基因共同作用的数量性状。

　　表5抗病性遗传分析

　　Table5Theinheritanceanalysisofdiseaseresistanceng

　　杂交组合

　　Crossing

　　combination

　　病害类型

　　Types of

　　disease

　　株数

　　Plant

　　No

　　亲中值

　　MP

　　value

　　病情指

　　数均值

　　The average

　　of DI

　　变异

　　系数

　　CV

　　（%）

　　组合传递力

　　（%）

　　Combination

　　heritability

　　超亲比率（%）

　　Transgression rate

　　超高亲

　　Ultra high

　　parent

　　低于低亲

　　Ultra low

　　parent

　　秦冠×富士

　　Qinguan×Fuji

　　褐斑病

　　Brown blot disease

　　385

　　27.6

　　27.9±18.38

　　72.4

　　99.3

　　32.9

　　20.6

　　斑点病

　　Alternaria leaf blotch

　　322

　　20.4

　　20.0±13.8

　　89.3

　　98.5

　　23.7

　　22.7

　　富士×秦冠

　　Fuji×Qinguan

　　褐斑病

　　Brown blot disease

　　385

　　27.7

　　36.1±25.4

　　67.8

　　130.0

　　38.4

　　18.4

　　斑点病

　　Alternaria leaf blotch

　　322

　　20.4

　　20.1±15.2

　　75.6

　　98.6

　　28.5

　　20.9

　　注：病情指数取2006-2008年平均值。Note:Diseaseindexistheaveragevalueof2006-2008years.

　　杂交F代抗病性发生广泛分离，表型丰富，病情指数变异系数较大（表5所示）。F代的褐斑病平均病情指数高于亲中值，组合传递力为114.6%，表明褐斑病遗传中非加性效应占有较大比重，杂交后代由于非加性效应解体，抗病性有降低的趋势，超高亲率比较高。F代的斑点病平均病情指数接近亲中值，组合传递力为98.5%，表明秦冠与富士杂交后代抗斑点病的遗传主要受加性效应控制，基因加性方差贡献大，能较稳定的遗传给后代，在F代中选择抗病单株的潜力大。

　　2.4抗斑点病基因RAPD分子标记

　　从325个RAPD随机引物中挑选在双亲间具多态性的68个引物，在亲本、抗病和感病DNA池中扩增，发现有18个（26.5%）引物可以扩增出稳定可重复的多态性条带。其中S428-900这个差异条带在秦冠及抗病DNA池中出现，而在富士及感病DNA池中没有出现，因此初步判断S428-900与抗斑点病基因相连锁（图2）。

　　图2引物S428对亲本和抗病池、感病池DNA扩增的结果

　　M：DNAladder;P1:秦冠；P2:富士；R:抗病基因池；S:感病基因池；1-7:感病单株；8-14:抗病单株

　　Fig.2PCRamplificationresultsofthePrimerS428inparents,resistantandsusceptiblepools

　　M:DNAladder;P1:Qianguan;P2:Fuji;R:Resisrantpool;S:Susceptiblepool

　　1-7:Susceptibleindividuals;8-14:Resisrantindividuals;

　　用引物S428对秦冠×富士组合的2个亲本及71个后代杂种展开扩增。

　　结果表明，在40株抗病个体中有30株出现了约900bp的片段，占75%，而在31株感病单株中有26株没有出现这一片段，占84%。这与田间抗斑点病自然鉴定结果相近。对S428-854特异条带进行了测序，其准确长度为854bp，登录GenBank（EU710766）。

　　2.5RAPD标记的SCAR转换

　　对两亲本、抗病和感病基因池及对应的F代分离群体的基因组DNA进行PCR扩增（图3），结果发现在抗病的后代个体中扩增出分子量大小为470bp的条带，而在感病个体中没有该条带的出现，故将470bp处扩增的特异条带命名为SCAR470。

　　图3SCAR-470特异引物在亲本、基因池及F部分单株DNA中的扩增

　　M:DNAMarker（DL2000）；P:秦冠；P:富士；RB:抗病池；SB:感病池；1-7:抗病单株；8-14:感病单株

　　Fig.3AmplificationprofilesofSCAR-470specificprimerinparents,bulksandsomeindividualsofF1progeny

　　M:DNAMarker（DL2000）；P:Qinguan;P:Fuji;RB:Resistantbulk;SB:Susceptiblebulk;

　　1-7:Resistantindividuals;8-14:Susceptibleindividual

　　用所获得的SCAR标记对“秦冠”与“富士”种间杂交的128株F代分离群体进行扩增，结果显示，杂交后代中的抗斑点落叶病后代67株中有65株扩增出了470bp大小的特征带，感斑点落叶病后代61株中有4株扩增出了470bp大小的特征带，SCAR引物在大量F代分离群体中检测的结果与已有的RAPD标记结果相符。对分离群体进行分析，说明该SCAR标记与抗斑点落叶病的基因位点的重组率为4.69%，小于10%，重组个体指未扩增出470bp条带的抗病个体及有此扩增条带的感病个体。因此，这是检测苹果对斑点落叶病抗病性状的一个十分有效的分子标记，可以用来筛选抗病性状的杂交分离群体。

　　3讨论

　　果树病害的遗传研究比较困难，关于苹果主要病害（白粉病、黑星病、火疫病等）的抗性遗传研究，大部分学者认同数量性状遗传这一观点。本研究结果表明，苹果抗褐斑病和斑点病落叶病是主效基因控制的微笑多基因共同作用的数量性状遗传，与辽宁果树所认为苹果褐斑病是由多基因控制的数量性状这一观点相符，但是石萌坪、Saito等认为苹果斑点落叶病是由隐性单基因控制的质量性状，土屋七郎认为有3个性质相同的加性位点控制斑点病的抗性，有贡献基因3个以上则抗病。本研究中，两种病害F个体抗病性有较大的分离，病情指数呈连续变异，不符合标准的正态分布规律，连续3年调查发现部分植株的抗性表现受环境因素的影响比较大，因此初步认为苹果对这两种病害的抗性属于数量性状遗传。本研究只对秦冠、富士这一杂交组合的正反交进行了抗褐斑病和斑点病遗传趋势的初步研究，欲探明这两种病害的详细遗传机理，需选择抗性不同的多个亲本设计配对杂交进行深入细致的研究。抗病性是多基因或者数量性状控制符合生物进化趋势，Machardy等报道所有的主效基因抗病性都只是暂时的，病原菌获得相应的毒性基因后，克服这种抗性只是时间问题，因此，多基因或者数量性状控制的抗病性较单基因控制的抗病性在进化上更有优越性。

　　亲本选择是抗病育种的基础，抗病性不同的亲本组合F个体的抗病性存在明显差异。阎振立等通过对7个杂交组合后代轮纹病抗性研究发现，两个抗病品种选配杂交组合，后代对轮纹病的抗性较好，宋润刚等研究表明，山葡萄种间杂交后代对霜霉病抗性倾向于抗病亲本，后代群体抗病性主要由亲本抗病性决定，杂交组合中抗病亲本越多，分离出的抗病单株越多，“抗病基因”有累加效应。本研究结果显示，正反交组合对斑点病的抗性存在较明显差异，以秦冠为母本的杂交后代抗性较好，后代抗性与亲本抗性水平存在相关性，说明苹果斑点病的抗性可以通过亲本遗传给后代，且抗性存在母性遗传的趋势；正反交组合F对褐斑病的抗性差异比较小，高抗单株比率相近，可能受环境因素的影响比较大。因此，抗病育种时要选择抗病能力强、遗传性好的品种，才能获得理想的育种效果。研究结果显示，F个体对两种病害的抗性没有显著相关性，初步推测这两种抗病基因不连锁，位于同一染色体相对较远的位置，或位于不同的染色体上，这一观点与张振文等在葡萄抗霜霉病和白粉病遗传的观点不同，他们认为自交后代对两种病害的抗病性属于伴随遗传现象，这种伴随遗传现象是由抗病基因的多效性引起的。

　　DNA分子标记已成为苹果遗传育种研究中的一个有效的研究方法和辅助育种手段，但是在生产实践中的应用还不普及，仍需较长时间的探索和检验。本文对苹果抗斑点落叶病基因进行了RAPD标记，并成功转换为重复性和特异性更好的SCAR标记，这些标记的实践应用有待进一步详细研究，同时我们正在开展早期落叶病的SSR标记研究。参考文献

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